Tentang alat ini
Masukkan sekuens primer untuk memperkirakan suhu lelehnya (Tm), suhu di mana separuh dupleks menjadi untai tunggal. Sekuens diubah ke huruf besar dan dikurangi menjadi A, C, G, T dan U sebelum basa dihitung. Semuanya dihitung di peramban Anda.
Metode dasar menggunakan aturan Wallace untuk primer pendek (di bawah 14 nukleotida): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Untuk primer 14 basa atau lebih ia beralih ke rumus berbasis GC Tm = 64,9 + 41 × (GC − 16,4) / panjang. Metode yang disesuaikan garam menerapkan Tm = 81,5 + 0,41 × GC% − 675 / panjang + 16,6 × log10([Na⁺]), di mana konsentrasi natrium dimasukkan dalam milimolar, untuk memperhitungkan kondisi bufer.
Suhu penempelan yang disarankan sekitar Tm − 5 °C diberikan sebagai titik awal praktis untuk PCR, bersama dengan GC% dan panjang primer. Misalnya, 8-mer ATGCATGC (4 A/T dan 4 G/C) memberikan Tm Wallace sebesar 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Pertanyaan yang sering diajukan
Kapan aturan Wallace digunakan?
Metode dasar menerapkan aturan Wallace, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), pada primer yang lebih pendek dari 14 nukleotida. Pada 14 basa atau lebih ia menggunakan rumus berbasis GC yang lebih akurat sebagai gantinya.
Apa yang ditambahkan metode yang disesuaikan garam?
Ia mengoreksi Tm untuk konsentrasi ion natrium bufer reaksi menggunakan suku log, karena garam yang lebih tinggi menstabilkan dupleks dan menaikkan suhu leleh.
Bagaimana suhu penempelan dipilih?
Aturan praktis umum menetapkan suhu penempelan PCR sekitar 5 °C di bawah Tm primer. Ini adalah titik awal yang dapat Anda optimalkan secara eksperimental.
Apakah nilai-nilai ini tepat?
Tidak. Ini adalah perkiraan tanpa tetangga terdekat yang berguna untuk estimasi cepat. Untuk pekerjaan kritis gunakan model termodinamika tetangga terdekat lengkap dengan konsentrasi garam dan primer Anda yang tepat.
Alat lainnya