Oszacuj temperaturę topnienia startera PCR regułą Wallace'a lub wzorem skorygowanym o sól, plus GC% i temperaturę przyłączania.
Tm to temperatura, w której połowa startera jest zhybrydyzowana; temperatura przyłączania to sugerowany punkt wyjścia dla PCR.
O tym narzędziu
Wprowadź sekwencję startera, aby oszacować jego temperaturę topnienia (Tm), temperaturę, w której połowa dupleksu jest jednoniciowa. Sekwencja jest zamieniana na wielkie litery i redukowana do A, C, G, T i U przed zliczeniem zasad. Wszystko jest obliczane w Twojej przeglądarce.
Metoda podstawowa używa reguły Wallace'a dla krótkich starterów (poniżej 14 nukleotydów): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Dla starterów o długości 14 zasad lub więcej przełącza się na wzór oparty na GC: Tm = 64.9 + 41 × (GC − 16.4) / długość. Metoda skorygowana o sól stosuje Tm = 81.5 + 0.41 × GC% − 675 / długość + 16.6 × log10([Na⁺]), gdzie stężenie sodu jest wprowadzane w milimolach, aby uwzględnić warunki buforu.
Sugerowana temperatura przyłączania około Tm − 5 °C jest podawana jako praktyczny punkt wyjścia dla PCR, wraz z GC% i długością startera. Na przykład 8-mer ATGCATGC (4 A/T i 4 G/C) daje Tm wg Wallace'a 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Najczęściej zadawane pytania
Kiedy używana jest reguła Wallace'a?
Metoda podstawowa stosuje regułę Wallace'a, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), do starterów krótszych niż 14 nukleotydów. Przy 14 zasadach lub dłuższych używa dokładniejszego wzoru opartego na GC.
Co dodaje metoda skorygowana o sól?
Koryguje Tm o stężenie jonów sodu w buforze reakcyjnym za pomocą członu logarytmicznego, ponieważ wyższe stężenie soli stabilizuje dupleks i podnosi temperaturę topnienia.
Jak wybierana jest temperatura przyłączania?
Powszechna reguła kciuka ustawia temperaturę przyłączania PCR około 5 °C poniżej Tm startera. To punkt wyjścia, który możesz optymalizować eksperymentalnie.
Czy te wartości są dokładne?
Nie. To przybliżenia bez modelu najbliższego sąsiada, przydatne do szybkich szacunków. Do pracy krytycznej użyj pełnego termodynamicznego modelu najbliższego sąsiada z Twoimi dokładnymi stężeniami soli i startera.