PCR primer erime sıcaklığını Wallace kuralı veya tuz düzeltmeli bir formülle tahmin edin; GC% ve tavlama sıcaklığı ile birlikte.
Tm, primerin yarısının hibritlendiği sıcaklıktır; tavlama sıcaklığı önerilen bir PCR başlangıç noktasıdır.
Bu araç hakkında
Erime sıcaklığını (Tm) — çift ipliğin yarısının tek iplikli olduğu sıcaklığı — tahmin etmek için bir primer dizisi girin. Bazlar sayılmadan önce dizi büyük harfe çevrilir ve A, C, G, T ve U'ya indirgenir. Her şey tarayıcınızda hesaplanır.
Temel yöntem, kısa primerler için (14 nükleotidin altında) Wallace kuralını kullanır: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). 14 baz veya daha uzun primerler için GC tabanlı formüle geçer: Tm = 64.9 + 41 × (GC − 16.4) / uzunluk. Tuz düzeltmeli yöntem, tampon koşullarını hesaba katmak için sodyum konsantrasyonunun milimolar cinsinden girildiği Tm = 81.5 + 0.41 × GC% − 675 / uzunluk + 16.6 × log10([Na⁺]) formülünü uygular.
PCR için pratik bir başlangıç noktası olarak yaklaşık Tm − 5 °C'lik bir önerilen tavlama sıcaklığı, primerin GC% ve uzunluğu ile birlikte sağlanır. Örneğin, 8 bazlık ATGCATGC (4 A/T ve 4 G/C), 2×4 + 4×4 = 24 °C'lik bir Wallace Tm'i verir.
Sık sorulan sorular
Wallace kuralı ne zaman kullanılır?
Temel yöntem, 14 nükleotidden kısa primerlere Wallace kuralını, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), uygular. 14 baz veya daha uzunda ise bunun yerine daha doğru GC tabanlı formülü kullanır.
Tuz düzeltmeli yöntem neyi ekler?
Bir logaritma terimi kullanarak Tm'i reaksiyon tamponunun sodyum iyonu konsantrasyonuna göre düzeltir; çünkü daha yüksek tuz, çift ipliği kararlı kılar ve erime sıcaklığını yükseltir.
Tavlama sıcaklığı nasıl seçilir?
Yaygın bir pratik kural, PCR tavlama sıcaklığını primer Tm'inin yaklaşık 5 °C altına ayarlar. Bu, deneysel olarak optimize edebileceğiniz bir başlangıç noktasıdır.
Bu değerler tam mı?
Hayır. Bunlar, hızlı tahminler için yararlı komşusuz yaklaşımlardır. Kritik çalışmalar için tam bir en yakın komşu termodinamik modelini, kesin tuz ve primer konsantrasyonlarınızla kullanın.