Calcolatore della temperatura di fusione (Tm) del primer
Stima la temperatura di fusione del primer PCR con la regola di Wallace o una formula corretta per il sale, più GC% e temperatura di annealing.
La Tm è la temperatura alla quale metà del primer è ibridata; la temperatura di annealing è un punto di partenza suggerito per la PCR.
Informazioni su questo strumento
Inserisci una sequenza di primer per stimarne la temperatura di fusione (Tm), la temperatura alla quale metà del duplex è a singolo filamento. La sequenza viene resa maiuscola e ridotta ad A, C, G, T e U prima che le basi vengano contate. Tutto viene calcolato nel tuo browser.
Il metodo di base usa la regola di Wallace per i primer corti (meno di 14 nucleotidi): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Per i primer di 14 basi o più passa alla formula basata sul GC Tm = 64,9 + 41 × (GC − 16,4) / lunghezza. Il metodo corretto per il sale applica Tm = 81,5 + 0,41 × GC% − 675 / lunghezza + 16,6 × log10([Na⁺]), dove la concentrazione di sodio è inserita in millimolare, per tenere conto delle condizioni del tampone.
Una temperatura di annealing suggerita di circa Tm − 5 °C è fornita come punto di partenza pratico per la PCR, insieme al GC% e alla lunghezza del primer. Per esempio, l'8-mero ATGCATGC (4 A/T e 4 G/C) dà una Tm di Wallace di 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Domande frequenti
Quando si usa la regola di Wallace?
Il metodo di base applica la regola di Wallace, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), ai primer più corti di 14 nucleotidi. A 14 basi o più usa invece la formula più accurata basata sul GC.
Cosa aggiunge il metodo corretto per il sale?
Corregge la Tm per la concentrazione di ioni sodio del tampone di reazione usando un termine logaritmico, poiché un sale più elevato stabilizza il duplex e alza la temperatura di fusione.
Come viene scelta la temperatura di annealing?
Una regola pratica comune fissa la temperatura di annealing della PCR circa 5 °C al di sotto della Tm del primer. È un punto di partenza che puoi ottimizzare sperimentalmente.
Questi valori sono esatti?
No. Sono approssimazioni prive del modello nearest-neighbour, utili per stime rapide. Per lavori critici usa un modello termodinamico nearest-neighbour completo con le tue esatte concentrazioni di sale e di primer.