Оцініть температуру плавлення PCR-праймера за правилом Уоллеса або сольовою формулою, плюс GC% і температуру відпалу.
Tm — це температура, за якої половина праймера гібридизована; температура відпалу — це пропонована відправна точка для PCR.
Про цей інструмент
Введіть послідовність праймера, щоб оцінити його температуру плавлення (Tm) — температуру, за якої половина дуплекса є одноланцюговою. Послідовність переводиться у верхній регістр і зводиться до A, C, G, T та U перед підрахунком основ. Усе обчислюється у вашому браузері.
Базовий метод використовує правило Уоллеса для коротких праймерів (менше 14 нуклеотидів): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Для праймерів з 14 основ і більше він переходить на GC-формулу Tm = 64.9 + 41 × (GC − 16.4) / довжина. Сольовий метод застосовує Tm = 81.5 + 0.41 × GC% − 675 / довжина + 16.6 × log10([Na⁺]), де концентрація натрію вводиться в мілімолях, щоб врахувати умови буфера.
Пропонована температура відпалу приблизно Tm − 5 °C надається як практична відправна точка для PCR, разом із GC% і довжиною праймера. Наприклад, 8-мер ATGCATGC (4 A/T та 4 G/C) дає Tm за Уоллесом 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Поширені запитання
Коли використовується правило Уоллеса?
Базовий метод застосовує правило Уоллеса, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), до праймерів, коротших за 14 нуклеотидів. При 14 основах або більше він натомість використовує точнішу GC-формулу.
Що додає сольовий метод?
Він коригує Tm на концентрацію іонів натрію реакційного буфера за допомогою логарифмічного члена, оскільки вища концентрація солі стабілізує дуплекс і підвищує температуру плавлення.
Як обирається температура відпалу?
Поширене емпіричне правило встановлює температуру відпалу PCR приблизно на 5 °C нижче Tm праймера. Це відправна точка, яку ви можете оптимізувати експериментально.
Чи є ці значення точними?
Ні. Це наближення без урахування найближчих сусідів, корисні для швидких оцінок. Для критичної роботи використовуйте повну термодинамічну модель найближчих сусідів з вашими точними концентраціями солі та праймера.