Оцените температуру плавления ПЦР-праймера по правилу Уоллеса или формуле с поправкой на соль, плюс GC% и температуру отжига.
Tm — это температура, при которой половина праймера гибридизована; температура отжига — это предлагаемая отправная точка для ПЦР.
Об этом инструменте
Введите последовательность праймера, чтобы оценить его температуру плавления (Tm) — температуру, при которой половина дуплекса становится одноцепочечной. Последовательность приводится к верхнему регистру и сводится к A, C, G, T и U перед подсчётом оснований. Всё вычисляется в вашем браузере.
Базовый метод использует правило Уоллеса для коротких праймеров (менее 14 нуклеотидов): Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Для праймеров из 14 оснований и более он переключается на формулу на основе GC: Tm = 64.9 + 41 × (GC − 16.4) / длина. Метод с поправкой на соль применяет Tm = 81.5 + 0.41 × GC% − 675 / длина + 16.6 × log10([Na⁺]), где концентрация натрия вводится в миллимолях, чтобы учесть условия буфера.
Предлагаемая температура отжига около Tm − 5 °C предоставляется как практическая отправная точка для ПЦР вместе с GC% и длиной праймера. Например, 8-мер ATGCATGC (4 A/T и 4 G/C) даёт Tm по Уоллесу 2×4 + 4×4 = 24 °C.
Часто задаваемые вопросы
Когда используется правило Уоллеса?
Базовый метод применяет правило Уоллеса, Tm = 2(A+T) + 4(G+C), к праймерам короче 14 нуклеотидов. При 14 основаниях и более он использует более точную формулу на основе GC.
Что добавляет метод с поправкой на соль?
Он корректирует Tm с учётом концентрации ионов натрия в реакционном буфере с помощью логарифмического члена, поскольку более высокое содержание соли стабилизирует дуплекс и повышает температуру плавления.
Как выбирается температура отжига?
Распространённое эмпирическое правило устанавливает температуру отжига ПЦР примерно на 5 °C ниже Tm праймера. Это отправная точка, которую вы можете оптимизировать экспериментально.
Точны ли эти значения?
Нет. Это приближения без учёта ближайших соседей, полезные для быстрых оценок. Для критически важной работы используйте полную термодинамическую модель ближайших соседей с вашими точными концентрациями соли и праймера.