关于此工具
输入一段引物序列即可估算其解链温度（Tm），即一半双链变为单链时的温度。序列会先被转为大写并只保留 A、C、G、T 和 U，然后统计碱基。所有计算都在你的浏览器中完成。
基础方法对短引物（少于 14 个核苷酸）使用 Wallace 规则：Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)。对于 14 个碱基及以上的引物，则改用基于 GC 的公式 Tm = 64.9 + 41 × (GC − 16.4) / 长度。盐校正方法采用 Tm = 81.5 + 0.41 × GC% − 675 / 长度 + 16.6 × log10([Na⁺])，其中钠离子浓度以毫摩尔（mM）输入，以计入缓冲液条件。
工具还会给出约为 Tm − 5 °C 的建议退火温度，作为 PCR 的实用起点，并附上引物的 GC% 和长度。例如，8 聚体 ATGCATGC（4 个 A/T 和 4 个 G/C）的 Wallace Tm 为 2×4 + 4×4 = 24 °C。
常见问题
何时使用 Wallace 规则？
基础方法对短于 14 个核苷酸的引物应用 Wallace 规则 Tm = 2(A+T) + 4(G+C)。在 14 个碱基或更长时，改用更精确的基于 GC 的公式。
盐校正方法增加了什么？
它用一个对数项按反应缓冲液的钠离子浓度校正 Tm，因为更高的盐浓度会稳定双链并提高解链温度。
退火温度是如何选定的？
常用的经验法则是把 PCR 退火温度设为比引物 Tm 低约 5 °C。这只是一个起点，你可以通过实验加以优化。
这些数值精确吗？
不精确。这些是不含最近邻校正的近似值，适合快速估算。对于关键工作，请使用完整的最近邻热力学模型，并采用你的确切盐浓度和引物浓度。